无细胞蛋白表达与纯化服务
无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统。无细胞蛋白表达系统模拟生物细胞的生命现象，重现胞内蛋白转录翻译过程，它需要包含蛋白质合成过程中所必需的各种原料能量和各种蛋白因子。无细胞蛋白质合成体系是以外源目的mRNA或DNA为模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和能量，在细胞抽提物的酶系中合成目的蛋白质的体外蛋白合成系统。
该系统尤其适于膜蛋白和毒性蛋白的表达，同时具有周期短、通量高的特点。
该系统已有10多年历史，但是技术难度大。目前全球范围内，无细胞表达主要以Rothe、Promega等公司试剂盒表达方案为主，条件单一，价格昂贵。我公司掌握了基于大肠杆菌无细胞表达体系全套核心技术的公司。自2015年建立该平台以来，成功制备162种蛋白，其中包含99种传统大肠杆菌表达系统难以表达的1-12次跨膜蛋白和毒性蛋白，其中有分子量高达130kDa-140kDa的高次跨膜蛋白。
系统优势
- 没有细胞结构的限制，可以表达对宿主细胞有强毒害作用的外源蛋白
- 反应通量高，能在多孔板上按照多种不同的条件，多种不同的蛋白同时平行进行。适合进行高通量的蛋白质组学研究
- 可添加非天然的氨基酸或同位素标记氨基酸合成符合特殊用途的蛋白质
- 步骤少，实验流程简单，设备依赖低，可极大地提高工作效率
- 可以以PCR为模板直接表达，制备周期短
实验流程
服务类型
| 步骤 | 实验项目 | 实验流程 | 周期 |
|---|---|---|---|
| 1 | 质粒构建及制备 | 密码子优化、全基因合成 | 15-20工作日 |
| PCR扩增产物酶切连接到pET系列载体上 | |||
| 重组质粒大量制备 | |||
| 2 | 小试表达及优化 | 多载体多反应条件优化，SDS-PAGE电泳检测，以确定最优反应条件 | 5工作日 |
| 3 | 目标蛋白表达及纯化 | 根据小量结果提供1-10ml放大体系表达 | 7-10工作日（多条件纯化方案时间另加3个工作日） |
| 通过亲和、离子交换及分子筛等多种层析方法纯化目的蛋白 | |||
| 4 | 其他（可选） | 通过酶切去除标签 | 1个工作日 |
| 所有蛋白都可以提供无菌操作和内毒素去除服务 | |||
| 5 | 质控 | 进行纯度、浓度等检查，并提供QC报告 | 3-5工作日 |
| 总时间 | 25-35工作日 | ||
案例展示
10次以上超高难度跨膜蛋白
离子通道蛋白CLCN3
全长818aa；15次跨膜
氨基酸通道蛋白SLC7A11
全长501aa；12次跨膜
活性蛋白案例展示
CCR2（全长374aa；7次跨膜）
Activity: Measured by its binding ability in a functional ELISA. Immobilized CCR2 at 1 μg/ml can bind human CCL2, the EC50 of human CCL2 protein is 41.51-83.15 μg/ml.
ACKR2（全长384aa；7次跨膜）
Activity: Measured by its binding ability in a functional ELISA. Immobilized ACKR2 at 1 μg/ml can bind human CCL2, the EC50 of human CCL2 protein is 23.52-30.99 μg/ml.
