重组蛋白的生产工艺流程
日期:2024-01-26 10:17:03
蛋白质具有重要的功能,因此被广泛应用于工业、营养和医疗领域。DNA 重组技术是生产大量特定蛋白质的一种重要方法,该技术通过基因重组将多种来源的遗传物质结合在一起,创造出基因组中天然不存在的 DNA 序列。利用 DNA 重组技术生产的蛋白质就是所谓的重组蛋白。
为了帮助你更好地了解重组蛋白是如何产生的,本文将介绍这些内容:
什么是重组 DNA?
如何制造重组 DNA?
什么是重组蛋白?
如何生产重组蛋白?
1. 什么是重组 DNA?
要弄清什么是重组 DNA 以及如何利用重组 DNA 技术生产特定蛋白质,首先应该了解生物体内蛋白质表达的相关知识。
对于任何生物体来说,蛋白质都是构成机体并发挥重要功能的最重要物质之一。例如,人之所以能够消化食物,是因为消化道分泌消化酶,将食物中的大分子分解成可以被人体吸收的小分子。所有这些酶都是蛋白质。
自从 DNA 螺旋结构于 1953 年被发现以来,人们对遗传原理进行了广泛的研究。现在,人们已经清楚地认识到,蛋白质是由 DNA 通过两个步骤制造出来的。第一步称为转录,即从 DNA 生成 mRNA。下一步是翻译,由 mRNA 生成蛋白质。换句话说,DNA 序列提供了制造特定蛋白质的指令。因此,基因表达实际上与蛋白质表达具有相同的含义。
重组 DNA(rDNA)是由两个或多个 DNA 序列组合而成的 DNA 链。基因重组是一个自然发生的过程。这一过程也可以为各种目的进行人工操作,这就是所谓的 DNA 重组技术。利用 DNA 重组技术,科学家能够创造出在正常情况和环境条件下不会自然存在的新 DNA 序列。由此产生的重组 DNA 被放入宿主细胞,在那里表达成一种新的蛋白质,这就是所谓的重组蛋白。DNA 重组技术在生产用于制药、医疗、农业和其他用途的重组蛋白方面发挥着至关重要的作用。
2. 如何制造重组 DNA?
DNA 重组技术还有其他名称,包括 DNA 克隆、分子克隆和基因克隆。它们都是指将外来 DNA 转移到生物体内可自我复制的遗传元件中,最终导致外来 DNA 的扩增。目前,制造重组 DNA 的方法主要有以下三种:
① 转化
将外来 DNA 片段切割并插入载体,通常是质粒。然后,将产生的载体放入宿主细胞,如大肠杆菌,在其中表达外来 DNA 片段。细菌细胞吸收外来 DNA 的过程称为转化。
② 非细菌转化
非细菌转化不使用细菌作为宿主细胞。其中一个例子是 DNA 微注射,即把外来 DNA 直接注射到受体细胞的细胞核中。生物弹射法是一种利用高速微弹丸将外来 DNA 射入受体细胞的方法。
③ 噬菌体导入
噬菌体导入法是利用噬菌体将外来 DNA 转入宿主细胞,最终将含有外来 DNA 的噬菌体 DNA 植入宿主细胞的基因组。
3. 什么是重组蛋白?
重组蛋白是通过 DNA 重组技术人工制造的蛋白质。蛋白质可用于许多领域,如诊断工具、疫苗、治疗剂、洗涤剂、化妆品、食品生产和饲料添加剂等。仅仅从天然来源中分离蛋白质无法满足日益增长的蛋白质需求。DNA 重组技术为获取大量蛋白质提供了一种更有效的方法。
这种方法有利有弊。例如,胰岛素是一种对血糖起关键调节作用的激素,糖尿病患者的胰岛素会减少,而 DNA 重组技术已经生产出了胰岛素,挽救了许多人的生命。此外,DNA 重组技术还可以操纵相关蛋白质的特性。从这些方面来看,DNA 重组技术和重组蛋白都是有益的。然而,人们对使用重组 DNA 技术的安全性和伦理道德仍有担忧。
4. 如何生产重组蛋白?
重组蛋白的生产曾经是专家的领域。现在,由于简单的商业化系统的发展,重组蛋白的生产已经成为一项非常成熟和广泛的技术。在重组蛋白的生产过程中,仍然存在的一个挑战是,你将面临一系列令人困惑的选择。
应该使用哪种系统来表达蛋白质?
使用哪种表达载体?
蛋白质应该全长表达还是部分表达?
是否应该标记蛋白质?
如何纯化蛋白质?
……
在生产重组蛋白时,您必须做出很多决定。如果选择明智,就能获得高质量的重组蛋白,后续实验也更有可能成功。但如果决策失误,就可能得不到所需的重组蛋白,或者重组蛋白的质量和纯度达不到要求。
此外,由于每种蛋白质都不尽相同,因此没有永远正确的答案。如何在如此众多的生产策略中做出选择,很大程度上取决于你打算表达的蛋白质。
过去几十年来,人们利用 DNA 重组技术从各种生物(病毒、古生菌、细菌和真核生物)中生产出了大量蛋白质,并在实验室中进行了纯化。一些研究人员总结了重组蛋白生产的几个主要步骤,具体如下:
l 获取 cDNA 并创建表达克隆
l 克隆
l 在合适的系统中表达蛋白质
l 小规模试验表达
l 蛋白纯化
l 蛋白质表征
目前,表达重组蛋白的系统有很多种,包括基于细胞的系统和无细胞系统。基于细胞的系统又可分为真核系统和原核系统。最常用的五种表达策略如下:
无细胞表达系统表达重组蛋白
大肠杆菌表达系统表达重组蛋白
酵母表达系统表达重组蛋白
昆虫-杆状病毒表达系统表达重组蛋白
哺乳动物细胞表达系统表达重组蛋白
您可以点击这些链接,获取有关这些系统的更多信息。
所有表达系统的方法基本相似。其基本要求是:编码相关蛋白质的 DNA 序列、插入 DNA 序列的载体以及表达外来 DNA 序列的合适宿主。
尽管方法相似,表达系统的应用范围却各不相同。最常用的五种系统各有利弊。因此,在重组蛋白的生产中,表达系统的选择是一个关键的考虑因素。选择哪种表达系统主要取决于要表达的异源蛋白的性质。
如果您对选择合适的表达系统仍有疑问,可参考本页的表格 "哪种表达系统最适合您的实验?": www.cusabio.cn/Protein_Service.html
除了选择合适的表达系统,如何选择合适的表达载体也是生产重组蛋白的一个难题。如果要表达具有生物活性的蛋白质,还需要考虑其他因素。
影响重组蛋白表达的因素很多。例如,我们一般需要高产蛋白,但如果重组蛋白生产速度过快,可能会形成包涵体;许多重组蛋白需要糖基化等修饰,而糖基化只有真核细胞才有,因此在这种情况下,大肠杆菌等原核细胞不适合表达蛋白。
总的来说,重组蛋白生产是一项成熟的技术,市场上有多种系统可供选择。但在重组蛋白的生产和纯化过程中仍存在一些挑战。
为了帮助你更好地了解重组蛋白是如何产生的,本文将介绍这些内容:
什么是重组 DNA?
如何制造重组 DNA?
什么是重组蛋白?
如何生产重组蛋白?
1. 什么是重组 DNA?
要弄清什么是重组 DNA 以及如何利用重组 DNA 技术生产特定蛋白质,首先应该了解生物体内蛋白质表达的相关知识。
对于任何生物体来说,蛋白质都是构成机体并发挥重要功能的最重要物质之一。例如,人之所以能够消化食物,是因为消化道分泌消化酶,将食物中的大分子分解成可以被人体吸收的小分子。所有这些酶都是蛋白质。
自从 DNA 螺旋结构于 1953 年被发现以来,人们对遗传原理进行了广泛的研究。现在,人们已经清楚地认识到,蛋白质是由 DNA 通过两个步骤制造出来的。第一步称为转录,即从 DNA 生成 mRNA。下一步是翻译,由 mRNA 生成蛋白质。换句话说,DNA 序列提供了制造特定蛋白质的指令。因此,基因表达实际上与蛋白质表达具有相同的含义。
图 1 基因表达
重组 DNA(rDNA)是由两个或多个 DNA 序列组合而成的 DNA 链。基因重组是一个自然发生的过程。这一过程也可以为各种目的进行人工操作,这就是所谓的 DNA 重组技术。利用 DNA 重组技术,科学家能够创造出在正常情况和环境条件下不会自然存在的新 DNA 序列。由此产生的重组 DNA 被放入宿主细胞,在那里表达成一种新的蛋白质,这就是所谓的重组蛋白。DNA 重组技术在生产用于制药、医疗、农业和其他用途的重组蛋白方面发挥着至关重要的作用。
2. 如何制造重组 DNA?
图 2 重组 DNA
DNA 重组技术还有其他名称,包括 DNA 克隆、分子克隆和基因克隆。它们都是指将外来 DNA 转移到生物体内可自我复制的遗传元件中,最终导致外来 DNA 的扩增。目前,制造重组 DNA 的方法主要有以下三种:
① 转化
将外来 DNA 片段切割并插入载体,通常是质粒。然后,将产生的载体放入宿主细胞,如大肠杆菌,在其中表达外来 DNA 片段。细菌细胞吸收外来 DNA 的过程称为转化。
② 非细菌转化
非细菌转化不使用细菌作为宿主细胞。其中一个例子是 DNA 微注射,即把外来 DNA 直接注射到受体细胞的细胞核中。生物弹射法是一种利用高速微弹丸将外来 DNA 射入受体细胞的方法。
③ 噬菌体导入
噬菌体导入法是利用噬菌体将外来 DNA 转入宿主细胞,最终将含有外来 DNA 的噬菌体 DNA 植入宿主细胞的基因组。
3. 什么是重组蛋白?
重组蛋白是通过 DNA 重组技术人工制造的蛋白质。蛋白质可用于许多领域,如诊断工具、疫苗、治疗剂、洗涤剂、化妆品、食品生产和饲料添加剂等。仅仅从天然来源中分离蛋白质无法满足日益增长的蛋白质需求。DNA 重组技术为获取大量蛋白质提供了一种更有效的方法。
这种方法有利有弊。例如,胰岛素是一种对血糖起关键调节作用的激素,糖尿病患者的胰岛素会减少,而 DNA 重组技术已经生产出了胰岛素,挽救了许多人的生命。此外,DNA 重组技术还可以操纵相关蛋白质的特性。从这些方面来看,DNA 重组技术和重组蛋白都是有益的。然而,人们对使用重组 DNA 技术的安全性和伦理道德仍有担忧。
4. 如何生产重组蛋白?
重组蛋白的生产曾经是专家的领域。现在,由于简单的商业化系统的发展,重组蛋白的生产已经成为一项非常成熟和广泛的技术。在重组蛋白的生产过程中,仍然存在的一个挑战是,你将面临一系列令人困惑的选择。
应该使用哪种系统来表达蛋白质?
使用哪种表达载体?
蛋白质应该全长表达还是部分表达?
是否应该标记蛋白质?
如何纯化蛋白质?
……
在生产重组蛋白时,您必须做出很多决定。如果选择明智,就能获得高质量的重组蛋白,后续实验也更有可能成功。但如果决策失误,就可能得不到所需的重组蛋白,或者重组蛋白的质量和纯度达不到要求。
此外,由于每种蛋白质都不尽相同,因此没有永远正确的答案。如何在如此众多的生产策略中做出选择,很大程度上取决于你打算表达的蛋白质。
过去几十年来,人们利用 DNA 重组技术从各种生物(病毒、古生菌、细菌和真核生物)中生产出了大量蛋白质,并在实验室中进行了纯化。一些研究人员总结了重组蛋白生产的几个主要步骤,具体如下:
l 获取 cDNA 并创建表达克隆
l 克隆
l 在合适的系统中表达蛋白质
l 小规模试验表达
l 蛋白纯化
l 蛋白质表征
目前,表达重组蛋白的系统有很多种,包括基于细胞的系统和无细胞系统。基于细胞的系统又可分为真核系统和原核系统。最常用的五种表达策略如下:
无细胞表达系统表达重组蛋白
大肠杆菌表达系统表达重组蛋白
酵母表达系统表达重组蛋白
昆虫-杆状病毒表达系统表达重组蛋白
哺乳动物细胞表达系统表达重组蛋白
您可以点击这些链接,获取有关这些系统的更多信息。
图 3 在大肠杆菌表达系统中表达重组蛋白
所有表达系统的方法基本相似。其基本要求是:编码相关蛋白质的 DNA 序列、插入 DNA 序列的载体以及表达外来 DNA 序列的合适宿主。
尽管方法相似,表达系统的应用范围却各不相同。最常用的五种系统各有利弊。因此,在重组蛋白的生产中,表达系统的选择是一个关键的考虑因素。选择哪种表达系统主要取决于要表达的异源蛋白的性质。
如果您对选择合适的表达系统仍有疑问,可参考本页的表格 "哪种表达系统最适合您的实验?": www.cusabio.cn/Protein_Service.html
除了选择合适的表达系统,如何选择合适的表达载体也是生产重组蛋白的一个难题。如果要表达具有生物活性的蛋白质,还需要考虑其他因素。
影响重组蛋白表达的因素很多。例如,我们一般需要高产蛋白,但如果重组蛋白生产速度过快,可能会形成包涵体;许多重组蛋白需要糖基化等修饰,而糖基化只有真核细胞才有,因此在这种情况下,大肠杆菌等原核细胞不适合表达蛋白。
总的来说,重组蛋白生产是一项成熟的技术,市场上有多种系统可供选择。但在重组蛋白的生产和纯化过程中仍存在一些挑战。