单克隆抗体实验公司的步骤有哪些？
日期：2025-01-03 13:30:44
单克隆抗体实验主要包括以下几个关键步骤：
2、细胞融合
1、免疫动物
选择动物：一般选用 6-8 周龄雌性 Balb/c 小鼠，因为其遗传背景清晰，免疫反应较为稳定，且与常用的骨髓瘤细胞系在组织相容性上匹配较好，有利于后续的细胞融合和杂交瘤细胞的生长。
选择动物：一般选用 6-8 周龄雌性 Balb/c 小鼠，因为其遗传背景清晰，免疫反应较为稳定，且与常用的骨髓瘤细胞系在组织相容性上匹配较好，有利于后续的细胞融合和杂交瘤细胞的生长。
免疫方案制定：根据抗原的特性选择合适的免疫方案。对于可溶性抗原免疫原性弱的情况，通常要加佐剂，如福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。初次免疫时，一般每只小鼠注射 50μg 抗原加福氏完全佐剂，皮下多点注射，间隔 3 周左右；第二次免疫，剂量和途径同上，但使用福氏不完全佐剂；第三次免疫，剂量不变，不加佐剂，腹腔注射，7 天后采血测其效价；加强免疫，剂量 50μg，腹腔注射，3 天后取脾融合。
2、细胞融合
准备细胞：
骨髓瘤细胞：在融合前 48-36 小时，将骨髓瘤细胞扩大培养。融合当天，收集细胞，离心洗涤后重悬，进行活细胞计数备用。常用的骨髓瘤细胞系有 SP2/0 等。
脾细胞：取已经免疫的 Balb/c 小鼠，通过颈脱位致死，浸泡于 75% 酒精中消毒后，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液，计数备用。
融合操作：将骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例混合，通常为 1:5-1:10，加入促融合剂聚乙二醇（PEG）。在 PEG 作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养
3、选择性培养
培养基选择：一般采用 HAT 选择性培养基。在 HAT 培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤 - 鸟嘌呤 - 磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成 DNA 而死亡；未融合的淋巴细胞虽具有该酶，但本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤 - 鸟嘌呤 - 磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在 HAT 培养基中存活和增殖。
培养条件：将融合后的细胞悬液分装到 96 孔细胞培养板中，每孔 100μl，然后将培养板置 37℃，5% CO₂培养箱内培养。6 小时后补加选择培养基，每孔 50μl，3 天后用选择培养基半换液，经常观察杂交瘤细胞生长情况。
4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
筛选方法：通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）等，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。
克隆化培养：将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆扩增，可采用有限稀释法或软琼脂平板法等。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
5、单克隆抗体的大量制备
体内诱生法：取 Balb/c 小鼠，首先腹腔注射 0.5ml 液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2 周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约 1-2 周后，可见小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
体外培养法：将杂交瘤细胞置于培养瓶或生物反应器中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量相对有限。
6、单克隆抗体的鉴定
抗体特异性鉴定：采用 ELISA、免疫印迹、免疫组化等方法，检测单克隆抗体与目标抗原的特异性结合能力，确保其只与目的抗原反应，而不与其他无关抗原交叉反应。
抗体亲和力鉴定：通过表面等离子共振、生物膜层干涉技术等方法，测定单克隆抗体与抗原的亲和力常数，评估其结合的紧密程度和稳定性。
抗体效价测定：采用 ELISA 等方法，测定单克隆抗体的效价，即抗体的浓度或活性水平，以确定其在实验或应用中的有效性和适用性。
抗体亚型鉴定：采用 ELISA、免疫印迹等方法，确定单克隆抗体的免疫球蛋白类型和亚类，如 IgG、IgM、IgA 等及其亚型，了解其结构和功能特性。
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