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人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)酶联免疫分析ELISA试剂盒使用说明书

日期:2008-09-24 15:37:16

本试剂盒仅供研究使用

产品编号:CSB-E04655h

预期应用

ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中MCP-1含量。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中MCP-1水平。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入MCP-1抗原、生物素化的抗人MCP-1抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的MCP-1呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1.酶联板:一块(96孔)

2.标准品(冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为1000 pg/mL,做系列倍比稀释后,分别稀释成1000 pg/mL500 pg/mL 250 pg/mL125 pg/mL62.5 pg/mL31.2 pg/mL15.6 pg/mL,其原液直接作为最高标准浓度,样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/mL,临用前15分钟内配制。

如配制500 pg/mL标准品:取0.5ml 1000 pg/mL的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。

3.样品稀释液:1×20ml/瓶。

4.检测稀释液A1×10ml/瓶。

5.检测稀释液B1×10ml/瓶。

6.检测溶液A1×120ul/瓶(1100)临用前以检测稀释液A 1100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。

7.检测溶液B1×120ul/瓶(1100)临用前以检测稀释液B1100稀释。稀释方法同检测溶液A

8.底物溶液:1×10ml/瓶。

9.浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.终止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

标本的采集及保存

1.细胞培养物上清:请离心后收集上清,并将标本保存于-20℃,且应避免反复冻融。

2.血清:标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。

3.血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。

注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤

各试剂在使用前平衡至室温。

1.加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外,余孔分别加标准溶液或待测样品100ul,注意不要有气泡,轻轻混匀,酶标板加上盖,37℃反应120分钟。

2.弃去液体,甩干,不用洗涤。

3.每孔加检测溶液A工作液 100ul37,60分钟。洗板3次,350ul/每孔,甩干。

4.每孔加检测溶液B工作液 100ul37℃,60分钟,洗板5次,甩干。

5.依序每孔加底物溶液90ul37℃避光显色30分钟(此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显)。

6.依序每孔加终止溶液50ul,终止反应(此时兰色立转黄色)。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

注:

1 每次实