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抗体常见问题之IHC

问题 原因 解决方案
边缘效应 组织边缘贴附不牢,边缘组织松脱漂浮于液体中 APES/多聚赖氨酸处理玻片;组织切片尽量薄;尽量避免选用坏死较多的组织
试剂未充分覆盖组织 滴加试剂时让试剂完全覆盖组织
非特异性染色体 抗体质量问题 使用质量有保证的抗体
抗体孵育时间长 减少孵育时间
抗体浓度过高 降低抗体浓度
一抗为多抗 使用单克隆抗体
内源性过氧化物酶及生物素 延长灭活时间
封闭不足 延长封闭时间
DAB孵育时间过久或浓度过高 按说明书配置试剂,镜下控制反应时间
抗体孵育后洗涤不充分 每次孵育之后洗3*5次
滴加试剂时干片 及时滴加试剂
切片在缓冲液中浸泡过久 抗原修复之后及时封闭加一抗,不能过夜
阴性结果 抗体浓度及质量 选择有质量保证的抗体,先做预实验摸索抗体使用浓度
抗原修复不全 摸索合适的抗原修复方式及修复时间
抗原丰度 正常阴性
封闭时间过长 减少封闭时间
DAB孵育时间短 镜下控制显色时间
细胞通透不全,抗体未能进入细胞反应 选择合适的通透剂及其反应时间
一抗二抗不匹配 选择正确来源的二抗
脱片 玻片未处理好 玻片清洗干净后用APES或多聚赖氨酸处理
切片厚薄不均匀 更换刀片;调整好切片机状态
烤片时间或温度不够 60摄食度2小时
组织自身问题 肿瘤坏死组织及骨组织本身易脱片
抗原修复时温度迅速变化 抗原修复后让其自然冷却
操作时用力过猛 有脱片嫌疑的切片不要用力甩,用吸水纸吸干残余液体
染色弱 抗体浓度低,孵育时间短 提高抗体浓度,延长反应时间
试剂使用超过有效期 试剂定时更新
滴加试剂时残余缓冲液过多使试剂稀释 滴加试剂前尽量减少残余液体
封闭过度 减少封闭时间
着色不均匀 切片厚度不一致 更换刀片;调整好切片机状态
试剂配制未混匀使局部浓度不一致 试剂充分混匀后滴加
试剂未完全覆盖组织 滴加试剂时让试剂完全覆盖组织
脱蜡不完全 更换脱蜡剂或延长脱蜡时间