文献速递|龙牙草、五倍子与二者混合物,抗病毒活性哪家强?

浏览次数:49      日期:2021-08-26 17:22:10

2019年底爆发的COVID19疫情仍在全球肆虐。据统计,截至2021年3月5日,SARS-CoV-2的死亡率约为2.22%。面对SARS-CoV-2的高致死率和感染率,开发针对该病毒的抗病毒药物是当务之急。来自韩国的团队对龙牙草、五倍子和APRG64(二者混合物)之间的抗病毒活性进行了比较研究。研究结果发表在Bioorg.Med.Chem杂志上,附上全文链接

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龙牙草(Agrimonia pilosa)俗称多毛龙牙花,在韩国和中国广泛分布栽培,其地上部分已被用作抗病毒药,在东方医学中用于治疗便血、外伤和白带。五倍子(Galla rhois)为漆树科植物盐肤木、青麸杨或红麸杨叶上的虫瘿,主要由五倍子蚜寄生而形成。五倍子常用于肺虚久咳、久泻久痢、盗汗与皮肤湿烂等。

APRG64是龙牙草和五倍子按比例6:4混合经50% EtOH水提取的混合物。Yeong-Geun Lee等人之前研究结果已表明,APRG64是龙牙草与五倍子生物活性最大化的最佳选择,而且对心血管、中枢神经和呼吸系统没有显着的药理毒性。因此,他们猜想龙牙草、五倍子和 APRG64对SARS-CoV-2也同样具有抗病毒活性。为了证明这一猜想,他们开展了本次研究。该研究结果主要解决了以下几个问题:

 

1、龙牙草、五倍子和APRG64是否可以影响SARS-CoV-2的复制?

由于龙牙草、五倍子和APRG64具有治疗多种疾病功效,因此作者们首先对龙牙草、五倍子和APRG64的SARS-CoV-2抗病毒活性进行了分析。用龙牙草、五倍子、APRG64、瑞德西韦或磷酸氯喹预处理2小时后的Vero细胞感染SARSCoV-2。在感染后72小时(hpi),评估斑块形成的减少。如Fig.1A所示,龙牙草、五倍子和APRG64均对斑块形成有极大的抑制作用。另外,Yeong-Geun Lee等人分别在有或没有AP、RG、APRG64、瑞德西韦或磷酸氯喹的情况下处理已感染SARS-CoV-2的Vero细胞,1小时后,用PBS洗涤细胞3次来去除未附着的病毒和细胞培养基中的提取物,并评估斑块形成的减少。如Fig.1B所示,龙牙草、五倍子和APRG64对SARS-CoV-2的复制有强烈的抑制作用。值得注意的是,与龙牙草、五倍子和APRG64,瑞德西韦和氯喹没有显示出显着的抗病毒活性。这些结果表明龙牙草、五倍子和APRG64通过与瑞德西韦和磷酸氯喹不同的抗病毒机制干扰病毒进入,从而对 SARS-CoV-2表现出高效的抗病毒活性

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Fig. 1. Anti-SARS-CoV-2 activity of Agrimonia pilosa (AP), Galla rhois (RG), and their mixture (APRG64)

前面已经提到,APRG64是龙牙草、五倍子的混合物,由于其在体外和体内的安全性已在他们之前的研究中得到证实,因此在以下实验中对其活性成分进行了研究。

 

2、APRG64中抗SARS-CoV-2的活性成分是什么?

为了研究APRG64中抗SARS-CoV-2的活性成分,他们反复在这些植物中提取并分离出多种成分,包括熊果酸(1)、没食子酸乙酯(11)和1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-D-葡萄糖(12)。根据APRG64的LC/MS分析结果,选择了一种三萜类化合物(1)、一种香豆素(2)、八种黄酮类化合物(3-10)和两种没食子酸酯衍生物(11和12)作为APRG64的活性成分和潜在的抗COVID-19成分(Fig. 2)。

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Fig. 2. Chemical structures of isolated constituents from mixture of Agrimonia pilosa (AP) leaves and Galla rhois (RG) fruits in 50% EtOH extract (APRG64)

分理出这些活性成分后,作者们进一步探索了这些次级代谢物对SARS-CoV-2复制的抑制作用。感染SARS-CoV-2后的Vero细胞用化合物1-12、瑞德西韦或磷酸氯喹处理,1小时后,洗涤细胞以去除未附着的病毒颗粒和化合物。在72 hpi时,使用噬菌斑分析计算噬菌斑的数量。如Fig. 3A所示,三种浓度(1、5和25 µg/mL)的熊果酸(1)、槲皮素(7)、没食子酸乙酯(11)和1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-D-葡萄糖(12)均显着抑制斑块形成。与另外三种成分相比,没食子酸乙酯(11)的抑制效果较弱(减少率:25μg/mL时为21.05%)。这个结果在分析细胞上清液中的SARS-CoV-2刺突蛋白时得到了验证(Fig. 3B)。熊果酸(1)、槲皮素(7)和 1,2,3,4,6-penta-O-galloylβ-D-葡萄糖(12)显着减少了细胞上清液中SARS-CoV-2刺突蛋白的数量。

此外,他们还用熊果酸(1)、槲皮素(7)和1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-D-葡萄糖(12)进行后处理,看它们是否能够抑制SARS-CoV-2复制。如Fig. 3C所示,样品经这三种成分后处理后,上清中的SARS-CoV-2刺突蛋白显着减少

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Fig. 3. Antiviral activity of active components isolated from APRG64 against SARS-CoV-2. Vero cells were seeded 1 day before infection

这些结果表明APRG64的活性成分(熊果酸(1)、槲皮素(7) 和1,2,3,4,6-penta-Ogalloyl-β-D-葡萄糖(12))通过干扰病毒吸收和吸收后阶段来抑制SARS-CoV-2复制。

 

3、APRG64的活性成分能阻碍病毒RBD与宿主细胞的结合吗?

众所周知,病毒刺突RBD和宿主细胞上ACE2蛋白的结合是SARS-CoV-2进入细胞的关键步骤。由于APRG64及其成分被证明会干扰病毒吸收,所以作者猜想APRG64成分可能会阻碍病毒刺突RBD与宿主细胞的结合。

为了验证这一猜想,将病毒刺突RBD与APRG64的三种主要抗病毒成分(熊果酸(1)、槲皮素(7)和1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-D-葡萄糖)的结构进行分子对接分析。由于SARS-CoV-2的S棘突蛋白RBD会不断发生突变,所以,作者在这里分别分析了APRG64组分与SARS-CoV-2棘突RBD及其变体B.1.1.7棘突RBD的结合亲和力。

首先,作者通过全局模型质量估计(GMQE)和定性模型能量分析(QMEAN)生成并验证B.1.1.7突变株的RBD结构模型。然后,比较SARS-CoV-2 RBD和B.1.1.7突变株RBD与熊果酸 (1)、槲皮素(7)和1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-D-葡萄糖的分子对接分析来评估APRG64活性成分的潜在抗病毒作用(Table 1)。

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Table 1. Binding energy calculated from molecular docking analysis of SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain (RBD) and B.1.1.7 lineage spike RBD with three antiSARS-CoV-2 compounds of APRG64, ursolic acid (1), quercetin (7), and 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galloyl-β-D-glucose (12)

Table 1中的数据显示,与其他化合物相比,熊果酸(1)对 SARS-CoV-2 RBD和B.1.1.7突变株RBD显示出最高的结合能(分别为- 9.5 kcal/mol 和- 9.0 kcal/mol)。此外,他们还通过Autodock预测了SARS-CoV-2刺突RBD和B.1.1.7突变株刺突RBD与熊果酸(1)、槲皮素(7)和1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-D-葡萄糖三种APRG64活性成分的分子结合。这些结果均可对APRG64具有抗SARS-CoV-2和B.1.1.7突变株的病毒作用形成强有力的支撑。

简言之,这项研究表明APRG64是治疗SARS-CoV-2及其变体的有效候选药物。但是APRG64是否会成为治疗COVID-19的新型候选抗病毒药物仍需进一步的临床试验。

这项研究的关键部分用到了华美生物提供的SARS-CoV-2 spike RBD Nanobody (CSB-RA33245A2GMY)检测分析经病毒感染和样品预处理的细胞上清中SARS-CoV-2 spike proteins含量。

 

SARS-CoV-2 spike RBD Nanobody验证数据

>>活性验证:SARS-CoV-2 Spike RBD Nanobody与SARS-CoV-2-S1-RBD蛋白结合

Immobilized SARS-CoV-2-S1-RBD (CSB-YP3324GMY1) at 2 μg/ml can bind SARS-CoV-2 Spike RBD Nanobody, the EC50 is 0.8674 ng/ml.

>>活性验证:SARS-CoV-2 Spike RBD Nanobody和ACE2-HRP偶联物竞争性与SARS-CoV-2-S1-RBD结合

The binding signal of SARS-CoV-2-S1-RBD (CSB-YP3324GMY1) and ACE2-HRP (CSB-MP866317HU) conjugate was gradually reduced as this Nanobody concentrations increased. It indicated that this Nanobody effectively inhibited the SARS-CoV-2-S1-RBD/ACE2 binding. And the IC50 of this Nanobody is 1.296 nM.

>>中和实验验证:通过竞争性阻止SARS-CoV-2-S1-RBD与ACE2-HRP偶联物结合来检测 SARS-CoV-2 Spike RBD Nanobody的中和作用

The inhibition efficacy of the SARS-CoV-2-S1-RBD /ACE2 binding was positively proportionally to this Nanobody concentrations. It showed that this Nanobody effectively inhibited the SARS-CoV-2-S1-RBD/ACE2 binding. And the IC50 of this Nanobody is 0.1074 μg/ml.

>>活性验证:LSPR检测SARS-CoV-2 Spike RBD Nanobody与SARS-CoV-2 Spike protein RBD亲和力

SARS-CoV-2 Spike protein RBD His/Sumostar Tag (CSB-YP3324GMY1) captured on COOH chip binding to this Nanobody, increases the local refractive index (RI), leading to a red shift of the LSPR peak position. The detected affinity constant of SARS-CoV-2 Spike protein RBD/ this Nanobody binding is 28.2nM.

>>胶体金(GICA)实验验证

In the GICA detection system, the background of this nanobody antibody is clean, the detection limit can be as low as 25ng/ml (1.75ng/0.07ml), and the sensitivity is very good.

>>酶联免疫吸附实验(ELISA)验证

Immobilize various SARS proteins at concentration of 2μg/ml on solid substrate, then react with the nanobody at concentration of 100μg/ml, 10μg/ml and 1μg/ml. It shows this nanobody is specific for SARS-CoV-2-S1-RBD protein, without any cross-reactivity with MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43 or HCoV-229E.