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实验技术|免疫组化成功指南(IHC)&常见问题汇总

浏览次数:213      日期:2019年07月29日 08:58

免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

 

免疫组化技术(IHC)是一种综合定性、定位和定量;形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。常用于确认肿瘤或其他组织癌变的形态特征。在保持原组织成分、细胞特征以及结构的情况下,IHC利用抗体检测和分析该组织细胞中的蛋白质表达。
 
IHC是一项具有挑战性的应用技术,应用过程中常出现各种问题。本文旨在通过提供建议来帮助您改进IHC检测,减少您的实验优化过程,快速达到预期结果。
 
免疫组化步骤
 

△点击放大图片查看
 
 
·详细步骤来一波·
确定抗体信息无误,并准备好所需样本切片后,将切片依次放到染色架上,置于200 mL,2%的APES-丙酮溶液中1 min,立即放入烘箱中60℃,15 min,避免脱片。
➥ 脱蜡水化
从烘箱中取出染色架,放入染色盒中脱蜡。
(注:脱蜡时长随温度和脱蜡剂使用次数而定,30min~1h)
将经过脱蜡的染色架取出,沥干,依次放入无水乙醇的染色盒中。
放入3%的
H2O2中3min,以消除组织内源性过氧化物酶的活性。
放入pH7.4的PBS中静置。
➥高压抗原修复
高压锅中水浴至100℃,并将染色架放入其中。
(注:缓冲液加热过程中为防止烧杯中进入大量水蒸汽,需将烧杯口用保鲜膜封住)
➥ 封闭
用10%非免疫山羊血清封闭切片上的组织,置于湿盒中室温静置30min。
一抗孵育
将封闭液甩去,加入用1%酪蛋白稀释的一抗,4℃过夜。
将切片置于染色架中,放入PBST中洗涤四次。
➥ 二抗孵育 
切片上加入酪蛋白稀释的二抗置于湿盒中37℃孵育1h。
将切片置于染色架中,放入PBST中洗涤四次。
➥三抗孵育
切片的组织上加入酪蛋白稀释的三抗置于湿盒中37℃孵育1h。
将切片置于染色架中,放入PBST中洗涤三次。再放入PBS中洗涤二次。
➥DAB染色
切片的组织上加入DAB染色液,置于湿盒中室温放置10-15 min。
(注意显微镜下观察切片染色情况,染色到深黄且背景无明显着色可进行下一步)
将切片置于染色架中,放入PBS中洗涤二次,每次5min。
➥ 苏木素染色
切片的组织上加入苏木素染色液,置于湿盒中室温放置30min。

➥ 脱水封片
将染色架置于清水中洗涤浸泡30min,放入烘箱中烤干。
切片的组织上加入中性树胶,并加上盖玻片。 
➥ 显微镜观察并拍照
选取合适视野进行拍照。
 

IHC常见问题及解决办法

 
问题 原因 解决方案
边缘效应  组织边缘贴附不牢,边缘组织松脱漂浮于液体中 APES/多聚赖氨酸处理玻片;组织切片尽量薄;尽量避免选用坏死较多的组织
试剂未充分覆盖组织 滴加试剂时让试剂完全覆盖组织
非特异性染色体  抗体质量问题 使用质量有保证的抗体
抗体孵育时间长 减少孵育时间
抗体浓度过高 降低抗体浓度
一抗为多抗 使用单克隆抗体
内源性过氧化物酶及生物素 延长灭活时间
封闭不足 延长封闭时间
DAB孵育时间过久或浓度过高 按说明书配置试剂,镜下控制反应时间
抗体孵育后洗涤不充分 每次孵育之后洗3~5次
实验过程干片 及时滴加试剂
阴性结果  抗体浓度及质量 选择有质量保证的抗体,先做预实验摸索抗体使用浓度
抗原修复不足 摸索合适的抗原修复方式及修复时间
封闭时间过长 减少封闭时间
DAB孵育时间短 镜下控制显色时间
细胞通透不全,抗体未能进入细胞反应 选择合适的通透剂及其反应时间
一抗二抗不匹配 选择正确来源的二抗
脱片  玻片未处理好 玻片清洗干净后用APES或多聚赖氨酸处理
切片厚薄不均匀 更换刀片;调整好切片机状态
烤片时间或温度不够 60℃ , 2小时
组织自身问题 肿瘤坏死组织及骨组织本身易脱片
抗原修复时温度迅速变化 抗原修复后让其自然冷却
染色弱  抗体浓度低,孵育时间短 提高抗体浓度,延长反应时间
试剂使用超过有效期 试剂定时更新
滴加试剂时残余缓冲液过多使试剂稀释 滴加试剂前尽量减少残余液体
封闭过度 减少封闭时间
着色不均匀
切片厚度不一致 更换刀片;调整好切片机状态
试剂配制未混匀使局部浓度不一致 试剂充分混匀后滴加
试剂未完全覆盖组织 滴加试剂时让试剂完全覆盖组织
脱蜡不完全 更换脱蜡剂或延长脱蜡时间

 
华美IHC验证图示例

 
 
 
明明白白做实验
善其事前利其器
普通问题常规避
优化成功没问题
 
—END—
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