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好物好推荐:内参抗体!

浏览次数:92      日期:2018年11月28日 10:10

内参抗体

       内参即内部参照(Internal Control),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
       
       在Western Blot实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。
       此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
     
      常用的细胞总蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白β-Actin或β-Tubulin等。对于一些植物的样本,则需要特别的植物Actin蛋白作为内参。当实验样品中只是核蛋白,而不是细胞总蛋白提取液时,可以用组蛋白H(Histone H),或者增殖细胞核抗原(PCNA)等为核内参抗体。而在一些特别的针对线粒体作为微环境的研究课题时,则需要提取线粒体总蛋白并检测其中的目标蛋白含量,常用COX IV或VDAC1作为内参抗体。
       在选择内参时,需要综合考虑待检蛋白的分子量大小以及在细胞中的位置,内参与检测的目的蛋白的分子量应相差5kDa以上。
 
常见的内参抗体:
 
1)GAPDH内参抗体
GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶,由4个30-40kDa的亚基组成,分子量146kDa,检测条带大约在36kDa。 GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达,可广泛用作Western Blot蛋白质标准化的内参。
不适合用于检测30kDa-40kDa大小目标蛋白的WB实验中。在某些细胞中,由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高,也不适合做内参。
 
 
2)β-Actin内参抗体
Actin即肌动蛋白,是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,其余两种广泛分布于各种组织中,包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的,这是针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞浆内,表达量非常丰富,其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下,如脂肪组织或细胞内,β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成,分子量大小为42-43kDa左右。
适合用于检测38kDa-48kDa大小目标蛋白的WB实验中。在脂肪组织里,β-Actin的表达量非常低,不适合作为内参。
 
 
3)β-Tubulin抗体
Tubulin即微管蛋白,是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin,其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体,是形成微管的最主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分别为55kDa和50kDa,其实际检测条带均在55kDa左右。作为内参,β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变,因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照,也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。
不适合用于检测50kDa-60kDa大小目标蛋白的WB实验中。在脂肪组织或细胞内,β-Actin的表达量很少,不适合做内参。
 
 
Tips: 内参的选择还需考虑实际的实验环境:
 
在做多组织多细胞样本对比表达量时,最好选用GAPDH作为内参,因为GAPDH是代谢类蛋白,在活组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白,不同组织的细胞结构会有差异性。
做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时,应选择结构蛋白作为内参,如β-Actin 和β-Tubulin。
设计实验方案的时候应该考虑实际的实验因素并查询相应文献,在实验过程中也应该注意内参表达是否出现异常。
做 Western Blot实验时,内参的条带强度也要适当控制。不要让内参条带发生过度曝光的情况,尤其是用 X 胶片曝光的。如果内参条带过度曝光,条带会显得很宽,妨碍对条带正确强度的判读,进而影响对其他实验结果的判断。最好的内参结果是: 窄窄的,黑色实心条带。
 
华美内参抗体特别推荐
 
货号:CSB-MA000071M0m
种属反应性:Human
免疫原:Recombinant Human GAPDH protein
应用范围:ELISA, WB, IHC, IP, IF, FC
引用文献:A fluorescence method for determination of glucose transport by intestinal BBMV of common carp , Yang LP,et al.Anal Biochem,Aug 26
 
 
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