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Nanodiscs在膜蛋白中的应用

浏览次数:1014      日期:2018年02月01日 13:42

在上一期中,我们简单介绍了去垢剂的基本性质及其在膜蛋白中的应用。在含有去垢剂的缓冲中,大部分膜蛋白可以维持稳定性和活性。但少数对去垢剂敏感的膜蛋白是不适宜含有去垢剂的缓冲条件的,具体表现为无法纯化(例如纯化出的膜蛋白十分杂且得率非常低),稳定性不好(易于降解或有明显沉淀)和没有活性(可能该膜蛋白对去垢剂敏感,或其活性需要磷脂双分子层的结构)。针对这类膜蛋白,我们建议尝试nanodiscs技术。目前,Nanodiscs技术在膜蛋白的分离、纯化、结构研究和功能表征方面展现了重要的优势。本文介绍nanodiscs的成分和结构,nanodiscsliposomes的对比以及nanodiscs在膜蛋白中的应用。希望通过我们的介绍,可以帮助您进一步了解膜蛋白。

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1.Nanodiscs的成分和结构

Nanodiscs的主要成分是合成磷脂和两亲性螺旋蛋白(amphipathic helical protein),也叫做膜支架蛋白(membrane scaffold proteinMSP)。膜支架蛋白与血清载脂蛋白相关,而血清载脂蛋白是高密度脂蛋白的主要成分。2个膜支架蛋白为带状,环绕着磷脂,如下图Fig 1[1],即盘状磷脂双分子层Nanodiscs

Fig 1. Model of Nanodiscs structure viewed (a) perpendicular to the bilayer and (b) in the plane of the bilayer, based on the molecular belt model of discoidal HDL. Two monomers of the membrane scaffold protein (blue and cyan) form an amphipathic helical belt around a segment of phospholipid bilayer (in white)~10 nm in diameter. The model is courtesy of S. C. Harvey[1].

2. 模型膜

我们主要对比liposomesnanodiscs两种模型膜。

2.1 Liposomes

Liposomes是两亲性脂双层的囊泡。制备liposomes有许多方法,其中最有名最不要求设备的方法是Bangham[2]。将目的脂质溶解于挥发性有机溶剂中,在惰性气流下干燥。用水溶性缓冲涡旋所得的薄层脂质,然后通过各种方法,例如超声、均质化和用尺寸已知的过滤器挤出(一般为100-200nm孔径尺寸),最后转化为单层囊泡。这也导致了liposomes非常明显的劣势,不稳定、不均质、难以复制等。

Liposomes易于聚集和融合,通常在长时间或在某些物理操作下是不稳定的,例如停止流动或剧烈混合。通过挤出机制备的liposomes尺寸并不是均质的,不同批次制备可能存在明显差异[3]。组装入liposomes中的膜蛋白通常会导致样品浑浊和粘稠,这可能会限制一些生物化学分析技术的应用。

2.2 Nanodiscs

制备nanodiscs首先要准备包含磷脂、膜支架蛋白和去垢剂的混合物,一旦除去去垢剂,剩余的成分即组装为直径为8-16nm的盘状磷脂双分子层,即nanodiscs[4]Nanodiscs的直径由MSP带的长度决定,当磷脂与MSP处于最佳摩尔比时,即形成均匀的nanodiscs

对比liposomesNanodiscs的尺寸分布更加均质(在一次制备中)和一致(在不同批次的制备中);nanodiscs有更加精准的颗粒尺寸大小,可以通过调节MSP的序列长度来调节大小;nanodiscs更加稳定。

3.Nanodiscs在膜蛋白中的应用

关于Nanodiscs的应用,已经有非常优秀的综述[5],关于结构的研究可具体见下表,可应用于结构生物学,适用于电子显微镜、NMREPR和光谱检测技术等各种技术。

Table 1. Methods and tools used with MPs incorporated into nanodiscs

SPR, surface plasmon resonance; LSPR, localized SPR; CPR, NADPH–cytochrome P450 reductase[5].

4.利用大肠无细胞蛋白表达和nanodiscs技术表达AQPs

Cusabio结合大肠无细胞蛋白表达和nanodiscs技术,在大肠无细胞蛋白表达体系中加入预组装的nanodiscs。膜蛋白边翻译边组装入nanodiscs里,形成膜蛋白-nanodiscs复合物(Fig 2.)。这种模拟的人造脂质环境为分析不同的脂质对膜蛋白的影响提供了新的途经,让我们更好的理解膜蛋白。下图Fig 3.Escherichia coli Aquaporin Z(aqpZ)成功组装入nanodiscs后,SDS-PAGE的检测结果。由图可见有2条带,一条为MSP,一条为目的膜蛋白aqpZ

下图Fig 3.Escherichia coli Aquaporin Z(aqpZ)成功组装入nanodiscs后,SDS-PAGE的检测结果。由图可见有2条带,一条为MSP,一条为目的膜蛋白aqpZ

 

Fig 2. Schematic illustration of a MSP nanodiscs with a 7-transmembrane protein embedded.Diameter is about 10.6 nm. Picture from Sligar.

Fig 3.

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往期回顾:

Detergent的性质及其在膜蛋白中的应用

Refenrences

[1] Applications of Phospholipid Bilayer Nanodiscs in the Study of Membranes and Membrane Proteins. Abhinav Nath, William M. Atkins, and Stephen G. Sligar. Biochemistry, 2007, 46 (8), 2059-2069

[2] Large volume liposomes by an ether vaporization method. D Deamer, AD Bangham. Biochimica et Biophysica Acta, 443 (1976) 629-~34

[3] Applications of Phospholipid Bilayer Nanodiscs in the Study of Membranes and Membrane Proteins. Abhinav Nath, William M. Atkins, and Stephen G. Sligar. Biochemistry, 2007, 46 (8), 2059-2069

[4] Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Timothy H. Bayburt,Yelena V. Grinkova, and Stephen G. Sligar. Nano Letters, 2002, 2 (8), pp 853–856

[5]Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.Ilia G Denisov & Stephen G Sligar.Nature Structural & Molecular Biology 23, 481486 (2016)